多肽抗原免疫

動物選擇

要生成好的抗體,必須選擇與抗原源差異較大的動物。要想獲得最大的免疫反應,絕對不能讓免疫動物對抗原產生‘自體識別’。例如,要想生成抗人體蛋白的抗體,使用兔或老鼠比使用猴子要好。對于非常保守的哺乳動物蛋白,使用鳥類動物(如雞)效果較好。

動物免疫

我們通常使用弗氏佐劑(Freunds)與抗原進行混合。第一次注射完全使用Freunds的免疫輔助劑。輔助劑與抗原聯合使用,可以提高免疫反應,從而用較少的疫苗可以產生較強的免疫反應。佐劑可以使抗原緩慢釋放,從而產生持續性刺激。注射方式為多位點的皮下注射。每只注射動物都要先收集免疫前血樣,以用于和以后的免疫血樣比較。所采集的血清樣本含有不同的免疫型和亞型。

抗原準備-交聯方法

化學合成的多肽抗原是小分子, 本身很難具有好的抗原性,只能誘導動物產生很弱的免疫反應,因而與載體蛋白交聯是很重要的。載體蛋白含有很多抗原決定基,能夠刺激T-幫助細胞,進而誘導 B-細胞反應。用于與多肽交聯的載體蛋白有多種,其中最常用的是keyhole limpet hemacyanin (KLH), 牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA), 卵清蛋白(ovalbumin,OVA)和牛甲狀腺球蛋白(bovine thyroglobulin,THY)。KLH具有更高的抗原性,是最為常用的多肽交聯載體。BSA也常用來作為多肽載體,但由于BSA經常被用做檢測試驗的阻斷劑而使得該方法生產的抗體在應用上存在著一定的局限性。
  設計合成性多肽常常被忽略的一個方面是如何將多肽交聯到載體蛋白上。例如,N-端序列需要通過C-端氨基酸交聯,而C-端序列則需要通過N-端氨基酸交聯。內部序列則可以交聯到任何一端。內部序列交聯的另一考量則是將非共軛端酰基化或氨基化,因為原蛋白分子序列中不會含有帶電荷的末端。最常用的交聯方法都是基于自由氨基(alph-氨基 或 Lys)、sufhydryl (Cys)或羧基集團(Asp, Glu, 或 alpha-羧基)的存在。所有的交聯方法都應該是通過羧基或氨基端殘基將多肽交聯到載體蛋白上。所選序列不能有多個殘基都能參與所選交聯化學反應。如果多個反應位點存在,可以考慮將多肽序列縮短,或者選擇所有反應位點都位于一端的多肽。對于內部序列通常會使用離所預測抗原位點較遠的一端進行交聯,這樣可以避免可能的屏蔽問題。

抗體鑒定

檢測抗多肽反應是否發生的最簡單方法就是抗多肽ELISA。有兩種技術可以將多肽鏈接到ELISA板上。第一種方法就是直接將多肽鏈接到盤上。但如果鏈接氨基酸恰好是抗原決定簇的一部分,則抗體無法和多肽進一步鏈接,這樣產生假陰性結果的可能性增加。第二種方法則是先將多肽與載體蛋白耦合,然后將多肽-蛋白 耦合體鏈接到ELISA盤上。這種鏈接方法會使抗體-多肽的結合成功率提高,因為多肽不是直接嵌入盤膜,因而會更加暴露給抗體。這種方法因而更可靠,可重復性更高。需要注意的是,用于該方法的載體蛋白必須不同于用于免疫耦合的載體蛋白。這樣會避免血清中抗載體蛋白反應所導致的高背景反應。
當做血清檢測時,另一點需要記住的是,由于免疫多肽與自然多肽結構上的差別,檢測時的抗多肽反應與試劑的抗多肽反應可能是不同的。任何檢測,尤其是測定滴定量以決定收獲點時,必須包括針對天然狀態下蛋白的檢測。當然可以做針對天然狀態下蛋白的ELISA;但由于血清在不同檢測體系中表現會不一樣,因此最好在血清被日常使用的體系中進行蛋白識別鑒定。如果血清將用于免疫沉淀反應,就應該進行針對該反應的檢測。

多肽的序列的設計
多肽是用來模擬蛋白的,為了模仿蛋白的表現,我們需要合成與蛋白有相似的結構和電荷的多肽 。當一條肽段從一個蛋白中“切出”之后,兩端的電荷數將與基因體蛋白有差異。我們需要改變合成策略來使他們一致。

總體而言:

如果是出自蛋白C端的序列,通過乙酰化將N端屏蔽;

如果是出自蛋白N端的序列,通過酰胺化將C端屏蔽;

如果是出自蛋白中間部分,用乙酰化和酰胺化將兩端都屏蔽

多肽純度的定義
多肽的純度通常是通過HPLC,用每分鐘1%的標準乙腈梯度來檢測決定的。合成過程中,氨基酸之間的交聯效率不是總能達到100%,因而產生一系列的氨基酸缺失的雜質。大多數這樣的氨基酸缺失的雜質在純化過程中都被去掉了,但有少數的雜質其色譜表現與目標多肽很相近。這些氨基酸缺失的雜質肽留在了多肽樣品中就構成了余下的幾個百分點。

多肽的凈含量
干品多肽的重量中不僅僅包含多肽,還包含有一些非肽的組份,如水,被吸收的溶劑、配位離子和鹽等。 肽的凈含量是指肽在其中的重量百分比,這個百分比的數值范圍很大,可能從50%到90%,取決于純度、序列以及合成和純化的方法,不要將肽的凈含量和肽的純度混為一談, 它們是完全不同的兩個概念。純度通常是由HPLC決定的。純度定義的是多肽樣品中含正確序列的組分的百分比, 而肽的凈含量是指樣品中肽類物質相對于總物質所占的百分比,肽的凈含量通常是用氨基酸組分分析或紫外分光法測定的。這個信息主要是在一些對肽的濃度很敏感的實驗中,對計算肽的濃度是很重要的。
MAP的應用

MAP是復合抗原多肽,是將線型多肽的C端連接在多聚Lys核心上形成的分枝多肽,從而增大了整個分子的大小。雖然MAP減少了多肽與KLH交聯的步驟,然而由于MAP多肽的構象活動空間有限,通過它產生的抗體與通過KLH交聯法產生的抗體相比常常不能被蛋白識別。再者,做MAP時沒有自由的肽產生,因而很難除去對多聚Lys核心部分產生的抗體。HPLC純化MAP很困難。而且由于MAP分子的不均一性和很大的分子大小,也不能提供質譜鑒定。

抗原多肽交聯中常見問題

1、多肽與載體蛋白交聯
    對在動物體內產生免疫反應而言,大多數多肽的分子量都太小。將多肽與載體蛋白如KLH等交聯之后,不僅能增加抗原的大小,也能增強免疫性。我們可以提供與KLH和BSA兩種蛋白的交聯。大多數客戶選擇與KLH交聯,因為KLH的免疫性更好,而且BSA在很多實驗中作為Blocking試劑,由于動物體內既會產生對多肽的抗體也會產生對載體蛋白的抗體,這樣會出現假陽性。

2、抗體的使用
    由于抗體與很多生物分子,以蛋白和多肽等尤為顯著,有很強的結合能力,抗體在生物醫學研究中占據獨特的重要地位,在對蛋白的特性、含量的測定、分布情況的分析和蛋白的確證等方面都需要用到抗體。例如:診斷試劑盒如早孕試劑盒等,蛋白microalloy、immunohistochemistry 和普通的ELISA實驗等。由于抗體有對特定分子很強的結合能力的特點,用抗體進行體內治療成了許多努力的方向。成功的范例包括Genetech的Herceptin,用于治療一類特殊的乳腺癌和IDEC藥業公司的Ritaxan,用于特定類型的Non-Hodgkin`s Lymphomas B-細胞。

3、抗原和識別區域:
    大多數情況下,antigen和immunogen兩個字是可以互換使用的,它們的差別是很小的。他們是分別指一個分子與免疫系統之間的兩種類型的相互作用。一個immunogen是指能使一個生物組織的免疫系統產生免疫反應的分子,而一個antigen是指能與這種免疫反應的產物結合的分子,所以immunogen一定是antigen,但antigen不一定是immunogen,我們這里通用antigen,特指能與免疫反應的產物—抗體結合的分子。
識別區域(epitopes)是指一個抗原分子中一個與抗體直接結合的一段特定的序列,對于任何抗原(抗原蛋白),很有可能有多個抗體識別區域,對生產抗體而言,易于抗體識別的部位的識別區域最為理想。

4、進行KLH交聯的化學方法
    我們用MBS活化KLH,這樣能將載體蛋白(KLH)上面的自由-SH與多肽末端的Cys的側鏈-SH連接起來,這種方法直接,特異性高,而且穩定,通常選擇對免疫不重要的一端進行交聯。
EDC活化載體上的-COOH,將載體的-COOH和多肽的-NH2連接起來也是一種可行的方法。但我們只建議在多肽序列中有多個Cys時采用該方法。如果肽鏈中含有多個-COOH或-NH2基因,不建議使用該方法,因為會造成多重點交聯的情況,使多肽結構受影響。常用載體蛋白除KLH外,還有BSA,Ovalbumin等,造成KLH的優勢是它不干擾ELISA或Western Blot等實驗。

5、對抗原多肽交聯合適的肽鏈長度
    通常建議10-15個殘基進行交聯。肽鏈越長,抗體識別的區域越多,但也就越多機會形成穩定的二級結構。就不再是天然的形式了。太短的肽通常是沒有用的,除非有充足的理由,如與相關家族蛋白或其他蛋白有序列同源性等。

6、KLH交聯多肽溶液呈乳狀的原因
    KLH是一個很大的并且聚合的蛋白。因為它的結構和大小,它在水中的溶解度是很有限的,因此是乳狀,這并不影響它的免疫性,這種混濁的溶液可以直接免疫動物。

7、抗體的產量
    抗體的產量取決于很多因素:識別區域的選擇,多肽的合成,載體的交聯,免疫的操作步驟和動物的生理系統等等,因此抗體的產量是不等的。5-25mg都屬于正常范圍。

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