多肽基本信息

1.多肽合成的基本原理?
多肽固相合成法是多肽合成化學的一個重大的突破。它的最大特點是不必純化中間產物,合成過程可以連續進行,進而為多肽合成的自動化奠定了基礎。目前全自動多肽的合成,基本都是固相合成。其基本過程如下:
基于Fmoc化學合成,先將所要合成的目標多肽的C-端氨基酸的羧基以共價鍵形式與一個不溶性的高分子樹脂相連,然后以這一氨基酸的氨基作為多肽合成的起點,同其它的氨基酸已經活化的羧基作用形成肽鍵,不斷重復這一過程,即可得到多肽。根據多肽的氨基酸組成不同,多肽后處理方式不同,純化方式也有差異。

2.做免疫用的多肽多長為合適?
答:一般約10-15個氨基酸,當然長一些免疫效果好一些,不過合成費用也會增加。MAP多肽則希望長度在15aa以上,效果較好。另外,10aa以下的多肽免疫效果比較差。

3.免疫用多肽的純度需要很高嗎?
答:一般而言, 免疫用Peptide,70-85%即可。

4.我們合成的多肽溶解性不好,多肽就有問題對嗎?
答:很難準確預測一個多肽的溶解性及合適的溶劑是什么。如果多肽難以溶解就認為多肽合成有問題這個觀念并不正確。

5.多肽狀態是如何?如何保存儲存?
答:我們提供的多肽是粉末狀,一般為灰白色,組成不同,多肽粉末的顏色有差異,多肽一般長期保存需要避光保存,并應保存在-20度,短期可以保存在4度。可以短時間的話是以室溫運輸。

6.如何溶解多肽?
答:溶解多肽是非常復雜的事情,一般很難一下子確定合適的溶劑。通常是先取一點試驗,在沒有確定合適的溶劑前千萬不要全部溶解。
下列方法有助于您選擇合適的溶劑:
(1)判定多肽的電荷特定,設定酸性氨基酸Asp(D),Glu(E)和C端COOH為-1;堿性氨基酸Lys(K),Arg(R),His(H)及N端NH2為+1,其它氨基酸的電荷為0。計算出凈電荷數。
(2)如果凈電荷數 >0,多肽為堿性,用水溶解:如果不溶解或溶解性不大,加入醋酸(10%以上);如果多肽還不能溶解,加入少量TFA(25ul)溶解,然后加入500ul水稀釋。
(3)如果凈電荷數<0,多肽為酸性,用水溶解;如果不溶解或溶解性不大,加入氨水(25ul)溶解,然后加入500ul水稀釋。
(4)如果凈電荷數=0,多肽為中性,一般需要用有機溶劑如乙腈,甲醇或異丙醇,DMSO等溶解。還有人建議需要尿素來溶解疏水性很大的多肽。

7.非HPLC純化的多肽中有哪些雜質?
答:粗品和脫鹽級別的多肽中多肽和非多肽類雜質:如非全長多肽和多肽后處理的一些原料如DTT、TFA等

8.HPLC純化的多肽有哪些雜質?
答:經過HPLC純化的多肽,仍會有一些雜質存在,其中的雜質主要是短肽和微量TFA。

9.多長的多肽為合適?
答:多肽合成需要考慮多肽的長度,電荷,親疏水性等因素。長度越長,合成粗品的純度和產率都隨著降低,純化的難度和無法合成的幾率就會大些。當然多肽功能區的序列是無法改變的,但是為了多肽的順利合成,有時不得不在功能區的上下游增加一些輔助氨基酸,以改善多肽的溶解性和親疏水性。如果多肽太短,合成也可能有問題,主要問題是合成的多肽在后處理過程中有一定的難度,5肽以下的多肽,一般要有疏水的氨基酸,否則后處理難度加大。15個氨基酸殘基以下的多肽一般都可以得到滿意的產率和得率。

10.如何從多肽序列中判定多肽的溶解性?
(1)多肽中如果含有高比例的疏水性很強的氨基酸如和Leu,Val,IIe,Met,Phe和Trp,多肽很難溶解于水性溶液中或根本不可能溶解。這些氨基酸無論是純化或合成,都有可能有問題。
(2)一般情況下疏水性氨基酸的比例<50%,不能連續5個連續aa為疏水性,帶電荷的氨基酸的(正電荷K,R,H,N-terminus,負電荷D,E,C- terminus)的比例達到20%,在多肽的N或C短如果能增加極性氨基酸,也可以改善溶解性。

11.為什么含有Cys,Met,或Trp的多肽難合成?
答:含有Cys, Met,或Trp的多肽難以合成,同時難以獲得高純度的產品。主要因為這些基團不穩定,易氧化。這些多肽的使用和儲存都需要特別注意,避免反復開啟蓋子。

12.為什么有些多肽的合成產率或純度會比較低?
答:多肽合成與引子合成有比較大的區別,不能合成的引子很少,但是不能合成的多肽經常有。如Val,Ile,Tyr,Phe,Trp,Leu,Gln,和Thr這些氨基酸比鄰或重復時,多肽鏈在合成過程中不能完全舒展溶解,合成效率下降。以下幾種情形,合成效率和產物的純度都比較低,如:重復Pro,Ser-Ser,重復Asp,4個連續Gly等.

13.多肽是如何純化的?
答:多肽純化一般使用反相柱(如C8,C18等),214nm。緩沖體系通常為含TFA的溶劑,pH 2.0 。Buffer A為含0.1%TFA in ddH2O,Buffer B為1%TFA/ACN/ pH 2.0。純化前用Buffer A溶解;如果溶解不好,用Buffer B溶解后,然后用Buffer A稀釋;對疏水性強的多肽,有時還需要加入少量的Formic Acid或醋酸。HPLC分析多肽粗產物,如果多肽不長(15aa以下),一般會有主峰,主峰通常為全長產物;對于20aa以上的長肽,如果沒有主峰,HPLC需搭配Mass來判定分子量,進而確定哪個峰是所要合成的多肽

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