多肽標記和修飾

多肽標記和修飾


FITC Rhodamine B
FITC Conjugated Peptides FITC-Peptides Under Microscopy Rhodamine in 3d model Rhodamine B in solution

目前多肽標記及修飾的內容非常多,廣泛應用在多肽藥物,多肽生物學,多肽抗體以及多肽試劑的研究中。目前應用廣泛的有:非放射性核素標記(C13,H2,N15),熒光標記(FAM,FITC等),生物素標記,磷酸化修飾等。
1. 非放射性核素標記
目前在非放射性核素標記中,使用廣泛的仍然是C13,H2,因為其使用安全,放射性小。現在有比較完全的非放射性標記的氨基酸,可以按照正常的多肽合成方法將標記好的氨基酸直接連接到多肽上。
2. 熒光標記
熒光標記由于沒有放射性,實驗操作簡單。因此,目前在生物學研究中熒光標記應用非常廣泛,熒光標記方法與熒光試劑的結構有關系,對于有游離羧基的采用的方法與接肽反應相同,也采用HBTU/HOBt/DIEA方法連接。 在N端標記FITC的多肽需經歷環化作用來形成熒光素,通常會伴有最后一個氨基酸的去除,但當有一個間隔器如氨基己酸,或者是通過非酸性環境將目的肽從樹脂上切下來時,這種情況可避免。


3. 生物素標記
生物素-親合素系統 (biotin-avidin system,BAS),是70年代后期應用于免疫學,并得到迅速發展的一種新型生物反應放大系統。由于它具有生物素與親合素之間高度親和力及多級放大效應,并與熒光素、酶、同位素等免疫標記技術有機地結合,使各種示蹤免疫分析的特異性和靈敏度進一步提高。主要有用于標記多肽氨基的生物素N-羥基丁二酰亞胺酯(BNHS)和生物素對硝基酚酯(pBNP),其中以BNHS最常用,當然,也可以直接使用生物素也可以標記,因為其結構上有個游離的羧基,采用HBTU/HOBt/DIEA方法縮合,由于生物素的溶解度低,使用DMSO/DMF的混合溶劑增加溶解度。
4. 磷酸肽合成
磷酸肽在生命過程中發揮重要作用,磷酸化的位置在多肽上的Ser,Thr,Tyr。目前磷酸肽合成一般都采用磷酸化氨基酸,目前使用的都是單芐基磷酸化氨基酸。磷酸化氨基酸的連接一般采用HBTU/HOBt/DIEA方法,但是目前采用該方法合成磷酸化也有缺點,特別是在合成多磷酸化多肽或長肽的時候,連接效率低,最后產品純度很低,對于這種磷酸化多肽,我們考慮采用后磷酸化方法,其合成過程就是在多肽合成結束后,選擇性脫去要標記的氨基酸的側鏈保護基,對于Tyr,Thr可以直接使用側鏈不保護的氨基酸進行反應,而Ser可以采用Fmoc-Ser(trt),在1% TFA/DCM條件下可以定量的脫除。后磷酸化,采用雙芐基亞磷酰胺,四氮唑生成亞磷酰胺四唑活性中間體,連接到羥基上,隨后在過氧酸下氧化生成磷酰基,完成反應。

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